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    293T細胞怎樣才能養得好?

    發(fā)布時(shí)間: 2022-02-28  點(diǎn)擊次數: 2512次
     名稱(chēng)
     293T [HEK-293T] (人胚腎細胞) 
     形態(tài)
     上皮樣
     致瘤性
     +
     產(chǎn)物或抗原
     大T抗原
     生長(cháng)特性
     貼壁細胞
     營(yíng)養體系
     DMEM+10%FBS

    圖片


    來(lái)源:ATCC


    293 [HEK-293]細胞是經(jīng)人腺病毒5(Ad5)轉染而形成的人胚腎細胞永生化細胞系,293細胞包含并表達轉染的Ad5基因。


    293T細胞是293 [HEK-293]細胞株插入了SV40 T-antigen的溫度敏感基因形成的高轉衍生株,廣泛用于病毒包裝。其有多種衍生株,比如HEK293,293T/17等,來(lái)源都是人胚胎腎細胞,其極少表達細胞外配體所需的內生受體,且比較容易轉染,是一個(gè)很常用的表達研究外源基因的細胞株。


    293T細胞廣泛應用于病毒包裝,用磷酸鈣轉染效率可高達50%。蛋白表達水平高,轉染后2-3天用堿性磷酸酶分析可較容易地檢測到表達的蛋白。瞬時(shí)轉染293T細胞是過(guò)表達蛋白并獲得細胞內及細胞外(分泌的或膜上)蛋白的便捷方式。




    細 胞 特 性  


    1. 貼壁性差

      對貼壁因子很有要求,最好進(jìn)行包被;也可以提高血清比例來(lái)嘗試觀(guān)察一下;注意板材的親水性,細胞貼壁疏松,可只用EDTA消化,不要用胰蛋白酶過(guò)度消化。


    2. 增殖迅速

      細胞增殖非常快,通常倍增時(shí)間不到一天,隔天即可長(cháng)滿(mǎn),融合率不可過(guò)高,需要及時(shí)傳代。


    培 養 難 點(diǎn)  


     細 胞 聚 團 嚴 重 

    1. 為啥293T細胞傳代后聚團嚴重?

    圖片

    經(jīng)傳代后嚴重聚團的293T細胞

    圖片來(lái)源于客戶(hù)僅供參考


    原因推斷:胰酶消化操作不當導致細胞聚團。

    • 消化過(guò)度或吹打過(guò)猛導致細胞受傷嚴重,破損的細胞碎片容易粘連聚團。

    • 消化時(shí)細胞融合率太高,成片脫落,將不容易被吹散,容易聚團。


    解決辦法:鑒于該細胞貼壁疏松,普通0.25%胰酶消化時(shí)間控制15s-30s;吹打動(dòng)作輕柔,控制在10-20次;細胞融合率達到80%傳代即可傳代,不可長(cháng)的太滿(mǎn)。


    2. 為啥293T換了血清批次后聚團嚴重?

    圖片

    換血清批次后嚴重聚團的293T細胞

    圖片來(lái)源于客戶(hù)僅供參考


    原因推斷:血清來(lái)源于動(dòng)物,其組成成分有1000種左右,且血清組成及含量常隨供血動(dòng)物的年齡、生理條件和營(yíng)養條件而異。每個(gè)批號的組分百分比含量都是不固定的,所以批間差異是存在的。293T細胞本身有聚團生長(cháng)特性,但嚴重聚團可能受到血清里的某些因子刺激。


    解決辦法:先用血清試用裝,試用效果好,可購買(mǎi)和血清試用裝批次相同的正裝,囤積半年或一年的用量,有效避免批間差對細胞的影響(胎牛血清在-20℃保存可達5年)。


     貼 壁 性 差 

    1. 為什么用了新批號的血清,293T細胞貼壁性變差?

    圖片

    貼壁疏松的293T細胞

    圖片來(lái)源于客戶(hù)僅供參考


    原因推斷:血清存在批間差異,而293T細胞本身特點(diǎn)就是貼壁性差,對不同批次的血清適應性不同,就容易出現貼壁疏松現象。


    解決辦法:可適當加高血清比例(最高不超過(guò)20%);建議試好一個(gè)血清批次多囤一些,可以避免血清批間差對細胞的影響。


    2. 為啥293T細胞從瓶里(例如T25)鋪板到孔里(96孔板),貼壁性變差?

    原因推斷:排除掉瓶和孔板本身材質(zhì)或TC(親水處理)處理因素外,293T細胞貼壁性變差極有可能是因為空間的隔離導致細胞自分泌或旁分泌產(chǎn)生的信號分子濃度太低,不利于細胞的貼壁或增殖。


    解決辦法:在鋪板前,對孔板進(jìn)行明膠包被,可有效促進(jìn)細胞貼壁。


     轉 染 病 毒 后 細 胞 凋 亡 嚴 重 

    1. 為啥293T細胞轉染病毒后凋亡嚴重?

    圖片

    經(jīng)病毒轉染后漂浮凋亡的293T細胞

    圖片來(lái)源于客戶(hù)僅供參考


    原因推斷:在排查了方法步驟和轉染試劑,依然沒(méi)有改善的情況下,可排查一下轉染前的營(yíng)養體系,尤其是血清批間差帶來(lái)的影響。很多同學(xué)說(shuō)前期培養細胞形態(tài)正常呀,其實(shí)細胞形態(tài)學(xué)只是鑒別細胞是否健康的一個(gè)外在指標,還要結合細胞其它指標對細胞健康進(jìn)行評定(比如倍增時(shí)間,存活率)。


    解決辦法:通過(guò)更換血清批次,再進(jìn)行轉染實(shí)驗并觀(guān)察轉染后的效果,比較分析出原因。


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