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    細胞凍存保種

    發(fā)布時(shí)間: 2022-10-18  點(diǎn)擊次數: 1170次


    細胞生長(cháng)至對數中晚期,以培養基制備高濃度細胞懸液,加入細胞保護劑,等份轉移至凍存管中,緩慢冷凍。

    市場(chǎng)上有多家成熟的無(wú)血清凍存液,這些試劑簡(jiǎn)單實(shí)用,極其便捷。對一些難復蘇的細胞極其友好。但是對于長(cháng)期的細胞留庫保種還是建議采用傳統的方法。

    兩種凍存液比較
    方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)

    傳統DMSO/甘油凍存法  

     能較好的維持細胞的特性 一些細胞凍存效果不佳

    無(wú)血清無(wú)蛋白凍存法

    使用方便,對新手友善

    同樣含有DMSO,某些敏感細胞慎用

     


    原理


    傳統上的細胞凍存(甘油/二甲基亞砜做保護劑)講求的是:慢凍速溶。細胞凍存時(shí)向培養基中加入的甘油或二甲基亞砜(DMSO),這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外,減少細胞內冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。

     


    用途


    細胞保種


    材料與儀器


    【實(shí)驗材料】細胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA(或細胞刮刀)、100 X雙抗、PBS、胎牛血清、DMEM *培養基、75% 乙醇、胰酶、異丙醇;

    【儀器與用品】?jì)龃婀堋?7度恒溫水浴鍋、培養皿(6 cm)、細胞凍存盒(已添加異丙醇)或凍存泡沫盒、記號筆、-80度冰箱、倒置相差顯微鏡、凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養皿(6cm)、液氮罐、離心機、細胞房專(zhuān)用超凈臺、移液槍及移液槍頭(無(wú)菌或滅菌后烘干)、一次性細胞計數板、細胞自動(dòng)計數儀、培養箱、移液管。


    步驟


     1.  預先配制凍存液:按正常培養基:DMSO =9:1比列配制凍存液;

    2.  取對數生長(cháng)期細胞,用胰蛋白酶把單層生長(cháng)的細胞消化下來(lái),離心1000 rpm,5 min;

    3.  去除胰蛋白酶及舊的培養液,加入適量配制好的凍存培養液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數,調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/mL~1×107/mL;

    4.  將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;

    5.  在凍存管上標明細胞的名稱(chēng),凍存時(shí)間、細胞代數及操作者;

    6.     往凍存盒中加入異丙醇(在負八十冰箱中能以1℃/min的速度下降)放入負八十冰箱即可,建議12小時(shí)以上,一般可在負八十中保存半年至一年,長(cháng)期保存要轉移至液氮中;商用凍存液可以直接凍存管放負八十冰箱。

     


    注意事項


    1、液氮凍存不建議用國產(chǎn)凍存管,復蘇時(shí)容易爆管;

    2、消化細胞時(shí),不能過(guò)度消化;

    3、DMSO溶于DMEM培養基會(huì )放熱,應提前5-10分鐘配置凍存液。用凍存盒時(shí)避免異丙醇將標記擦掉;

    4、二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜,包括皮膚和橡膠手套。因此,應謹慎處理。將凍存管放入液氮時(shí),必須使用保護性手套和面罩。


    常見(jiàn)問(wèn)題


    1、細胞消化過(guò)度,導致復蘇時(shí)細胞狀態(tài)不好;

    2、負八十冰箱中長(cháng)期保存細胞效果不好,應及時(shí)將細胞轉移至液氮中;

    3、國產(chǎn)凍存管在液氮中容易漏液氮,導致復蘇時(shí)曝管,所以放液氮中盡量使用質(zhì)量較好的凍存管。


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